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Preeflow計量閥ECO-PEN700日益見長

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實驗動物：斷奶后（2~6個月）的關中奶山羊，均由西北農(nóng)林科技大學提供。主要試劑：胎牛血清、分離液、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-甘油磷酸鈉等試劑盒以及抗體均購于武漢博士德公司，其他試劑為國產(chǎn)分析提純。

1．2實驗方法

1．2.1動物模型選取選用斷奶后的關中奶山羊12只，雌雄不限，采用隨機區(qū)組設計的方法將實驗動物分成2組。1．2.2原代BMSCs的提取與培養(yǎng)選取斷奶的關中奶山羊，骨髓的抽取和MSCs的分離、培養(yǎng)按照馬勇江的方法進行。

1．2.3細胞鑒定取培養(yǎng)第2代細胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）調(diào)整細胞濃度1×107個/ml，細胞鑒定采用CD34-FITC、CD90-PE、CD14-perCP、CD54-APC對細胞標記，置4℃避光孵育30min以上，采用PBS洗1次，應用流式細胞儀進行表面抗原檢測。

1．2.4細胞誘導取第2代細胞移入HG-DMEM液進行培養(yǎng)誘導。

1．2.5礦化誘導鑒定采用堿性磷酸酶染色鑒定。

1．2.6腺病毒介導的VEGF轉(zhuǎn)染選擇生長良好的傳代細胞，待其生長70%匯合時，用AdVEGF165轉(zhuǎn)染（感染倍數(shù)為50∶1），設置對照組（只加DMEM）。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調(diào)5ml，24h后，換液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)。分別于第1、3、5、7、9、11、13和15d收獲上清,離心后-70℃保存。上清標本統(tǒng)一用VEGFELISA試劑盒檢測VEGF濃度。

1．2.7復合物培育將環(huán)氧乙烷消毒備用的大小為30mm×5mm×5mm的珊瑚羥基磷灰石仿生人工骨分別放置于6個培養(yǎng)皿中，每皿分別加入濃度為2×106個/ml的已轉(zhuǎn)染成功的MSCs，然后放入5％的CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞在材料上及周邊的生長情況，并照相記錄。隔天換液，培養(yǎng)3d，備用。

1．2.8手術方法全身麻醉取俯臥位，備皮，采用2%碘伏消毒術區(qū)，沿雙側腰背筋膜縱向切開，分離長肌和多裂肌，顯露雙側L5、6棘突，去除部分皮質(zhì)骨后*止血，然后按照分組的不同于雙側橫突間各自植入基因增強人工骨骨條和自體骨條，肌肉覆蓋固定，后逐層縫合切口并包扎。于術前、術中、術后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注，植入后分欄飼養(yǎng)，不限活動。

1．2.9手法觸診檢查植入物硬度，輕柔檢測L5、6活動度，無活動判定為融合，有活動判定為不融合。

1．2.10影像學檢測術后4、8、12周每只山羊拍攝前后位X線片，觀察植骨處骨小梁長入情況。有連續(xù)骨小梁長入的判定為融合，其他情況為不融合。

1．2.11組織學檢測12周后將動物處死，取出植入物，福爾馬林固定24h，環(huán)鋸水平修整后脫水，甲基丙烯酸輕乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋、切片，厚度為5μm。切片行HE染色，觀察。

1．2.12生物力學檢測處死動物后取受力方向的骨塊，大小為4mm×4mm×3mm，用材料試驗機測試，加載速度為2mm/min。采用點壓技術和直徑2mm的圓柱形壓頭，計算壓穿軟骨下骨板時的壓縮強度（從開始加載的基點斷裂點峰值之間的壓力與壓頭面積的比值），在應力應變曲線上計量其彈性模量。

1．3統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，定量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2．1細胞鑒定結果

剛接種的細胞為球形懸浮在胞液之中，混有少量的血細胞，4~5d后換細胞液，可見大量單核細胞呈圓形，未*貼壁；8~10d后換細胞液，可見單核細胞*貼壁，變成梭形及多角形，12d后大量單核細胞連接成片，形成纖維樣細胞集落，15~20d后細胞逐漸匯集，多呈長梭形及多角形，流式細胞儀檢測CD90和CD54為陽性，CD34和CD14為陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原特征。

2．2成骨細胞誘導鑒定

12～14d基質(zhì)礦鹽形成鈣化結節(jié)，堿性磷酸酶染色可見胞漿被染成棕黑色，并有黑色顆粒沉積，說明培養(yǎng)形成的細胞具有成骨細胞的特性，具有體外成骨的能力（此種細胞含量超過80%）。

2．3VEGF轉(zhuǎn)染結果

結果顯示轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清液中VEGF分泌顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01），分泌高峰在7～9d，此后逐漸下降，15d仍然可檢測到，且依然高于對照組。

2．4手法觸診

所有實驗動物均存活且未見異常反應，4周后均有活動度，8周后CHA-MSCs-VEGF組無活動度，12周后2組均無活動度。

2．5影像學檢測

4周后均未見骨小梁，8周后開始2組均可見骨小梁。

2．6組織學檢測

CHA-MSCs-VEGF組術后12周有少量軟骨及大量的連續(xù)骨小梁形成，可見皮質(zhì)骨圍繞，可見軟骨結構形成，之后成骨，成骨代謝活性已非常接近正常，植入材料與骨組織達到骨性融合，自體髂骨組術后12周可見新生骨組織形成，但其成骨能力不及CHA-MSCs-VEGF組。

2．7生物力學檢測

CHA-MSCs-VEGF組與自體組在大壓縮強度和彈性模量2方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3討論

MSCs是近幾年來研究熱門的干細胞，具有在一定的培養(yǎng)條件下，可以分化為骨細胞，維持一定時期內(nèi)細胞的生長形態(tài)穩(wěn)定、增殖速度較快、細胞的生存適應能力較強、貼壁時間短、成活率高等優(yōu)點，是目前骨組織工程中較為理想的種子細胞。本實驗采用Percoll梯度離心法，成功分離MSCs，并誘導其向成骨細胞分化。支架物質(zhì)CHA是以特定的天然優(yōu)質(zhì)珊瑚為原料，經(jīng)過一系列復雜的熱液置換反應，將珊瑚中的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)換為羥基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙，得到物理結構和無機成分與人體骨相似的產(chǎn)物，其不僅具有一定的機械強度和骨誘導物質(zhì)融合面積，而且其植入機體組織后有良好的生物相容性，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應，無炎癥排斥反應，具有良好的成骨潛能。為了促進上述人工骨能更好地與機體組織融合，本研究還加入了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），其為機體內(nèi)促進血管生長的重要的生長因子，在體內(nèi)外均可以特異性促進血管內(nèi)皮細胞的生長并誘導血管生成。*，臨床骨折的愈合快慢與病損處血供有著密切的關系，將VEFG基因轉(zhuǎn)染入人工骨的構建之中，可促進骨組織血管的形成、加速骨質(zhì)間的融合和生長。本實驗中，由觸診和影像學檢測發(fā)現(xiàn)，該基因增強人工骨在融合速度上快于自體髂骨，從組織切片上可看出，其成骨的質(zhì)量上比自體髂骨更加成熟，在生物力學的檢測中，該人工骨在大壓縮強度和彈性模量上均接近正常骨組織。綜上所述，CHA-MSCs-VEGF三聯(lián)人工骨復合物具有取材方便、培養(yǎng)簡單、相容性好、成骨迅速、生物力學強度高等優(yōu)點，有望廣泛應用于臨床植骨融合手術中骨骼的替代材料。